摘要：美洲幼蟲腐臭病是目前危害蜜蜂幼蟲生長的主要細菌病，不合理地使用抗生素防治該病是導致蜂產品抗生素殘留的重要因素。本文介紹了它的病原(Paeniballus larvae subspecieslaevae)和流行病學特征，并就目前檢測美洲幼蟲腐臭病痛原和防治該病的研究進展做一綜述。

關鍵詞：美洲幼蟲腐臭病 幼蟲芽孢桿菌 檢測防治

美洲幼蟲腐臭病(American foulbrood)，簡稱美幼病，是侵害蜜蜂幼蟲的一種細菌性病害。被感染的蜜蜂幼蟲平均在孵化后12．5天表現出癥狀，首先體色明顯變化，從正常的珍珠白變黃、淡褐色、褐色甚至黑褐色，同時蟲體不斷失水干癟，最后成緊貼于巢房壁的、黑褐色的、難以清除的鱗片狀物。該病于1907年確定，目前廣泛發生于溫帶與亞熱帶地區的幾乎所有國家，給這些國家的養蜂業帶來了嚴重的經濟損失。我國于1929～1930年間引進日本西方蜜蜂蜂種時將該病帶入，如今受其影響較嚴重(陳盛祿，2001)。美洲幼蟲腐臭病的病原具有極強的生命力，在曾經暴發美幼病的養蜂主產區普遍存在，因此，多數蜂場為防止美幼病的發生，采用飼喂抗生素的方法，這是造成蜂產品中抗生素殘留的重要因素，如果用藥劑量和時間稍不注意，就會引起抗生素殘留超標。研究美幼病的病原檢測方法和防治新技術對于準確對癥用藥，采用非抗生素藥物防治美幼病，減少或避免抗生素殘留具有重要意義。

1 病原

美洲幼蟲腐臭病由幼蟲芽孢桿菌(Paenibacillus larvae subspecies larvae)引起。它是一種革蘭氏陽性細菌，在一定條件下能產生芽孢，而且它產生的芽孢很有特色，一般細菌的芽孢外面只有4～5層結構包圍，但是幼蟲芽孢桿菌的芽孢卻有7層結構包圍，這種特殊的構造使得幼蟲芽孢桿菌的芽孢具有特別強的生命力，而且它對熱、化學消毒劑等都具有極強的抵抗力，在熱、干燥等惡劣環境下至少能存活35年。

目前已知幼蟲芽孢桿菌的基因型至少有5種，且不同基因型的細菌株系所導致的美洲幼蟲腐臭病的流行情況略有不同(Genersch E 等，2003；NeuenJorf S 等，2004)。不同基因型的幼蟲芽孢桿菌可以通過PCR技術和16SrRNA的編碼基因的限制性酶切片段多態性加以區別鑒定。

2 流行病學特征

美洲幼蟲腐臭病病害的流行是由幼蟲芽孢桿菌的芽孢引起的，而不是它的營養體。原因可能是蜜蜂幼蟲的食物具有一定的殺菌作用，比如花粉和蜂王漿中的一些脂肪酸和抗菌肽物質，它們對幼蟲芽孢桿菌的營養體有抑制和殺滅的作用(Manning R，2001；Bililtova K 等，2001；Bachanova K 等，2002)。

芽孢被蜜蜂幼蟲取食后，就在幼蟲的中腸萌發，然后穿過小腸組織，開始快速繁殖，最后殺死蜜蜂幼蟲。對芽孢的萌發來說，日齡越小的幼蟲其萌發條件越好，但對營養生長來說，則是老熟幼蟲最適宜。這是因為芽孢的萌發需要一個低氧壓的環境，而生長、繁殖及產生芽孢則需要高氧壓的環境(陳盛祿，2001)。所以不同蟲齡的蜜蜂幼蟲對幼蟲芽孢桿菌的敏感性差異非常大，1日齡的幼蟲對幼蟲芽孢桿菌高度敏感，通常只要不足10個芽孢就能使之患病，但是侵染2日齡以上的幼蟲，則需要數以百計的芽孢(Evans，2004)。另外有研究發現，成蟲蜜蜂對幼蟲芽孢桿菌有抵抗作用，原因是它們的中腸能產生一些可以抑制幼蟲芽孢桿菌生長和芽孢發育的物質。

幼蟲芽孢桿菌在蜜蜂群內的傳播可以是水平的，即通過錯投和盜蜂傳播，也可以是垂直的，即通過分蜂傳播，而在群間的傳播則主要是通過垂直傳播(Fries I 等，2001)。幼蟲芽孢桿菌的這種傳播方式使得它成為蜜蜂一種傳染性極強的疾病。由于芽孢只要在適宜的環境下就能萌發，所以美洲幼蟲腐臭病的發生沒有一定的季節性，病害能在一年中的任何一個有幼蟲的季節都有可能發生，但是一般在夏、秋季節發生的相對較多。氣候和蜜源對其發生有一定的影響，病群在優質蜜源大流蜜期到來時，病情會減輕，有些甚至能“自愈”，其原因主要有：①芽孢可能被采進的花蜜稀釋，從而降低了幼蟲從食物中接觸芽孢的機會；②花蜜的充盈刺激了蜂群中內勤蜂的清潔行為，內勤蜂發現和消除病蟲的能力增強；②剛采回的花粉作為幼蟲的食物，在一定程度上也減少了幼蟲被芽孢侵染的機會(Fries I 等，2001)。

3 病原鑒定

對于幼蟲芽孢桿菌的鑒定，早些時候一般先對其進行分離培養，然后進一步通過生化手段進行鑒定。但是由于幼蟲芽孢桿菌芽孢的生長比較特殊，它需要復雜的營養，在普通培養基上不能萌發也不能形成芽孢，需要專用的培養基，而且它的生長速度很慢，所以這樣的方法顯然比較花時間，而且還要依賴后面一系列復雜的生化方法。

于是就有人試圖發展一種選擇性培養基，希望通過分離培養就能鑒定出幼蟲芽孢桿菌，而不再需要接下來的生化鑒定。在這些探索中比較成功的是Alippi在1995年發明的一種半選擇性培養基。他在培養基中加了萘啶酮酸和pipennedic酸，由于幼蟲芽孢桿菌的生長比較特殊，它可以在加了萘啶酮酸和pipeMedic酸的培養基上生長，而其他大多數細菌則不能，從而可以將它們分離開。雖然這種方法相對比較簡便，但是卻不可避免的存在一定的假陽性現象。在此基礎上，在1999年，Govan V A 等報道可以使用PCR技術來分辨培養時出現的真假陽性，從而增加了上述方法的可信度間。

1999年，Stahly等從NE株系的幼蟲芽孢桿菌中分離得到了幼蟲芽孢桿菌噬菌體的致命性突變體PPLlc，并且證實幼蟲芽孢桿菌的幾乎所有株系都對PPLlc敏感，而其他細菌對PPLlc有抗性。這樣就使幼蟲芽孢桿菌培養后的鑒定變得更加簡單方便了，只要看是否有噬菌斑的出現就可以了。

但是上述這些方法的使用都需要幼蟲芽孢桿菌的培養，而前面已經提到幼蟲芽孢桿菌的培養是比較麻煩的，PCR技術的使用就克服了這一困難，它可以不需要經過培養，就能直接對蜂蜜中的芽孢進行鑒定。

2001年，Dobbelaere W等發展了一種以16Sr—RNA的編碼基因為引物的PCR技術來鑒定幼蟲芽孢桿菌的方法，實驗證明該方法快速、可靠，在4小時內就能做出正確的診斷。此后，Piccini C 等(2002)、Bakonyi T 等(2003)、AlipPi A M 等(2004)也相繼報道了可以使用PCR技術對蜂蜜中的芽孢進行快速直接鑒定。通過這些PCR技術的改進和引物的改良，現在我們已經可以在蜜蜂幼蟲尚未發病的時候檢測出低含量的芽孢，從而能夠防患于未然，控制美洲幼蟲腐臭病的大規模流行。

4 防治

由于美洲幼蟲腐臭病的存在歷史已經比較悠久，而且它的傳染性極強，破壞力很大，所以如何來有效的防治它是人們一直以來都非常關心的問題，相關的研究報道也很多，而其中研究最多的莫過于抗生素的使用。

早在1944年 Haseman 等就介紹用硫胺噻唑來治療美洲幼蟲腐臭病，1951年 Gochnauer 等報道土霉素治療美洲幼蟲腐臭病非常有效，而后的幾十年人們就普遍使用土霉素來防治美洲幼蟲腐臭病。但是近些年來人們越來越多的遇到了使用土霉素治療美洲幼蟲腐臭病效果下降的情況，有時甚至完全失效，后來證實是幼蟲芽孢桿菌對土霉素產生了抗性。

如何控制已經對土霉素產生了抗性的美洲幼蟲腐臭病成為蜂病防治的新課題。很多人將注意力投向了使用其他的抗生素來代替土霉素。2001年，Feldlaufer M F 等報道鹽酸林可霉素(lincomycin hy—drochloride)能有效地控制美洲幼蟲腐臭病，而且對蜜蜂的生長沒有毒性間。2002年，Elzen P 等報道泰樂菌素(tylosin)對控制有土霉素抗性的美洲幼蟲腐臭病很有效，而且它對蜜蜂的生長也沒有毒性。然而這些候選抗生素的發現或許會在一定時期內有效，但卻不能從根本上解決問題，因為新的抗生素的使用同樣還存在會使病原菌產生抗性的問題。

此外，抗生素的使用還有另外一個普遍的問題，就是抗生素會在蜂蜜中殘留，從而影響蜂產品的質量。相關的研究報道也很多，目前主要是通過HPLC—MS/MS方法來鑒定和測量蜂蜜中殘留的抗生素(Benetti C 等，2004；Ortelli D 等，2005)。最近，Kochansky J 報道泰樂菌素在蜂蜜中的降解很慢，它在34℃環境下轉變為脫炭霉糖泰樂菌素(desmycosin)的半衰期大約是4個月，而脫炭霉糖泰樂菌素在蜂蜜中相當穩定，在處理9個月以后，兩者在蜂蜜中的總量只減少了一點點。所以在使用泰樂菌素來治療美洲幼蟲腐臭病一定要小心它在蜂蜜中長期殘留的問題。

既然抗生素的使用存在上述兩個很難解決的問題，所以我們不能長期依賴抗生素來防治美洲幼蟲腐臭病，于是就試圖去尋找其他藥物和途徑。2001年，Bilikova K 等報道分離自蜂王漿中的一個多膚片段可以做為抑制美洲幼蟲腐臭病的潛在因子。2002年，Bachanova K 等通過多聚酰胺凝膠上細菌生長抑制試驗證實了蜂王漿中的抗菌肽抑制幼蟲芽孢桿菌生長的活性。2004年，Gallardo G L 等報道分離自蜂房花粉中兩個真菌株系的L—細交鏈孢菌酮酸(L－TenuMonicacid)表現出了對幼蟲芽孢桿菌生長的特殊抑制能力，其最小抑制濃度為32ug/mL，比現在普遍使用的土霉素的最小抑制濃度小。2004年，Aonstein K A 等報道蒜素(Allicin)具有抑制幼蟲芽孢桿菌生長的潛力，能在一定程度上減少美洲幼蟲腐臭病的發生。

除了使用藥物外，還可以輔助使用其他一些途徑。2001年，Del Hoyo M L 等就報道通過搬運感染美洲幼蟲腐臭病的蜂群到新的蜂場能夠減少其芽孢的攜帶量。同年，Spivak M等報道有衛生行為的蜂群抵制美洲幼蟲腐臭病有很大作用，有衛生行為的蜂群感染美洲幼蟲腐臭病的機率相對較小，而痊愈的機率則相對較大，而且產生蜂蜜的量也相對較多。

5 展望

隨著幼蟲芽孢桿菌對土霉素抗性的日益增強，迫切需要尋找新的藥物來代替，或者采用有效的飼養管理和育種技術來控制美幼病的發生。雖然相關的研究比較多，但是到目前為止還未得到大家普遍公認的安全高效的抗菌藥物，土霉素仍然是目前廣大蜂農普遍使用的抗菌藥。所以如何有效地篩選出安全高效的蜂用抗菌藥物，并研究出其最佳的用藥時間、用藥劑量、用藥方法，從而制定出一套科學的規范的方案對生產實踐具有重要的意義。另外，由于中草藥在中國的獨特地位，加上它長期使用不會產生抗性的優良特性，我們可以嘗試著尋找有效的中草藥來防治美洲幼蟲腐臭病。

引自《中國蜂業》2007（8）