很多人認(rèn)為，美國農(nóng)業(yè)部貝爾茲維里蜜蜂研究室的主要研究方向是蜜蜂病蟲害、非洲化蜜蜂以及蜂群防御與報(bào)警機(jī)制的研究。然而，1995年該研究室接受了一項(xiàng)新任務(wù)，研究蜜蜂種質(zhì)或生殖細(xì)胞的保存。
美國國會指示，美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究部門應(yīng)制定國家遺傳資源規(guī)劃，保存重要農(nóng)業(yè)物種的遺傳多樣性。農(nóng)業(yè)研究局在若干地區(qū)有保存作物品種的悠久歷史。但是，這項(xiàng)指令要保護(hù)動物，包括昆蟲也要保存。選擇蜜蜂作為三種模式昆蟲之一，它代表膜翅目的有益昆蟲，另外兩種昆蟲是家蠅(雙翅目)和粉紅棉鈴蟲(鱗翅目)都是重要害蟲。有些研究小組已在有效利用寒冷和自然滯育(冬眠)來保存蠅類和毛蟲(鱗翅目幼蟲)害蟲，但是，對昆蟲來說蜜蜂有一種獨(dú)特的方法，即人工授精。
一、蜜蜂人工授精和生存率
目前，蜜蜂是具備人工授精或器械授精完善方法的唯一昆蟲。自從20世紀(jì)20年代發(fā)展起來的蜂王人工授精設(shè)備是尖端的和多種多樣的，其中包括用于采集大量精液的哈勃氏注射器。本計(jì)劃的目標(biāo)之一是研制一種冷凍精液的方法。測試精子的存活率(這種方法現(xiàn)在應(yīng)用于許多物種)對研究有很大幫助。
精子用兩種不同的顏色染色，綠染料與精子頭內(nèi)的DNA結(jié)合，紅染料只在細(xì)胞死亡時進(jìn)入頭部。精于頭呈綠色的是活的，紅色頭是死的。我們計(jì)算若干個樣本，每個樣本100個精于細(xì)胞，求平均數(shù)。采用這種染色技術(shù)，我能試驗(yàn)多種冷凍處理，并直接評價精子。以前研究蜜蜂精液冷凍保存的研究人員，必須等待用處理的精液給蜂王授精，蜂王開始產(chǎn)卵，卵成熟到足以看出是否在工蜂房里的全部卵是工蜂(受精的)，還是蜂王在不適當(dāng)?shù)奈恢卯a(chǎn)了雄蜂(未受精卵)。
應(yīng)用生存率染色技術(shù)，能夠回答一些基本問題。用已知活精液水平，從0％(全部是死精子)到100％(新鮮精液)的精液樣本，就能說明用大于50％活精子授精的蜂王將產(chǎn)正常的工蜂幼蟲，至少持續(xù)產(chǎn)一個季度。用低于50％活精于授精的蜂王，在工蜂房里產(chǎn)不同程度的雄蜂。作為蜜蜂育種專家使用此項(xiàng)實(shí)用技術(shù)，50％活精子是冷凍保存精液精液樣本必須達(dá)到的存活率閥值。
采用冷凍后存活一半以上的精于給蜂王授精，就能在一個夏季培育新蜂王，這樣長的時間足以在育種程序中擴(kuò)大特殊的種群。
在設(shè)置存活率閥值時，研究人員還發(fā)現(xiàn)蜜蜂精子容易受到處理的傷害。精液是很濃的液體，為采集足夠一次授精用的精液或者想要保存采集來的大量的精液，使用注射器進(jìn)行人工授精時，要用力吸取精液，這就大大降低了精液的存活率。有些蜜蜂育種家采用從多只雄蜂采集精液的方法，將精液在稀釋液里混合，然后再用離心濃縮。從前發(fā)表的文章，離心的速度和時間對精子的存活率影響大，速度快會損傷精于。新發(fā)表的方法，采用對精于比較溫和、較低的速度，但是濃縮精液需要的時間較長。
二、遺傳力和生存率
阿根廷的安德雷博士在執(zhí)行養(yǎng)蜂發(fā)展綜合計(jì)劃，也采用這種精子生存率測定法來確定雄蜂之間的自然變異。發(fā)現(xiàn)雄蜂的自然變異很大，這種特殊的遺傳計(jì)量單位通稱為遺傳力。結(jié)果表明，精子生存率至少部分受遺傳的影響，在遺傳育種計(jì)劃中，從選擇雄蜂改善精子的生存率可以定為目標(biāo)。
三、精于冷凍保存
在液氮中冷凍生物組織，必須保護(hù)細(xì)胞不受損傷。與稀釋液一起，將細(xì)胞保護(hù)劑加到精液里。稀釋精液的冷凍和解凍的速度對精子的存活也很重要。安德雷博士等試驗(yàn)了多種曾經(jīng)用于蜜蜂精液的溶液，以確定其中那種最適宜作為儲存精液的稀釋液。有數(shù)種含鹽和糖的生理鹽溶液，pH為7和9，重量滲透壓濃度(溶液中滲透壓活動顆粒的總數(shù))在350和500，精于在這樣的溶液中是穩(wěn)定的，并且保持活力。
進(jìn)行一系列不同稀釋液、若干常用冷凍保護(hù)劑以及各種冷凍和解凍速度的試驗(yàn)，并且對精液樣本直接進(jìn)行測定。最終精液樣本的存活超過了50％的閥值水平。同樣也檢測了新鮮精液的稀釋液和冷凍保護(hù)劑對授精蜂王的影響。在夏季，計(jì)劃將所有這些信息綜合在一起，形成采集和冷凍精液的標(biāo)準(zhǔn)方法。我們將用冷凍和解凍的精于給一組蜂王授精，評價它們所產(chǎn)的工蜂幼蟲的質(zhì)量。
四、在室溫條件下的儲存
從人工授精的長期經(jīng)驗(yàn)，得知將采集的精液存放在室溫下是可能的，但不知是否能長期儲存。因此，將采集的精液，密封在毛細(xì)管中，放在黑暗房間里，室溫儲存1年。
令人喜悅的是，精子生存率至少在8周內(nèi)保持在高水平，然后慢慢下降。少數(shù)樣本沒有污染，密封很好，在儲存1年后發(fā)現(xiàn)它們的生存率高于50％的閥值。即便只能將精液保存數(shù)周，這種方法或許能給育種家某些自由，在有大量雄蜂時采集精液，保存到有了蜂王。
不幸的是，試用室溫下儲存1～8周的精液給蜂王授精，大部分蜂王產(chǎn)的是雄蜂卵。精于是活的。但是不執(zhí)行它們的任務(wù)。后來經(jīng)過多次試驗(yàn)，研制出一種稀釋劑剛好在授精前與精液混合，它將刺激精于達(dá)到正常的活動水平，在夏季將測試這種方法，評價產(chǎn)卵的蜂王。
五、蜜蜂卵的冷凍保存
研究計(jì)劃包括蜜蜂卵，卵3日內(nèi)發(fā)育成胚胎。開始這項(xiàng)研究時，已經(jīng)發(fā)表了在液氮中冷凍果蠅胚胎的成功方法。很幸運(yùn)是，能與研究者之一的田納西州立大學(xué)的彼得·梅休爾博士一起工作。這項(xiàng)措施已應(yīng)用到其他昆蟲的胚胎。
蜜蜂生物學(xué)使胚胎保存成為挑戰(zhàn)，因?yàn)楸仨殏€別地采集卵，它們太小在處理它們冷凍時比較困難。現(xiàn)在，有一套良好的措施采集卵，并能讓它們在孵化器中100％孵化。在研究果蠅過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)采用一定發(fā)育階段的胚胎，在冷凍后能得到較高的生存率。這對蜜蜂胚胎同樣有用，48小時的蜜蜂胚胎最能耐受冷凍。我們用精液試驗(yàn)的冷凍保護(hù)劑，同樣適用于蜜蜂胚胎。為了使冷凍保護(hù)劑進(jìn)入胚胎，必須將卵的外殼除去，用溫和的漂白(Clorox)溶液除去卵殼。然而用于果蠅和蚊蟲胚胎的溶劑會殺死蜜蜂的胚胎。
因此，研究停留在這一階段，能夠保存卵要比冷凍精液更令人激動。如果這些胚胎能孵化，培育到1日齡。將它們移至無王群，按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)蜂王將是件容易的事情。這樣培育出的蜂王能自然交配，不需要人工授精，也能培育出選作保存的遺傳種群的雄蜂。
六、自然儲存的蜂王如何
本計(jì)劃的最終日的是，進(jìn)一步地了解蜂王為什么能在相對高的溫度下儲存精液多年，精子仍然存活，能給卵授精。研究人員相互協(xié)作，開始了一項(xiàng)大膽的計(jì)劃，試圖發(fā)現(xiàn)蜂王受精囊里發(fā)生了什么，以及雄蜂對自然儲存的精于可能有什么影響?有一些早期的資料，若干種抗氧化劑能保護(hù)細(xì)胞避免隨時間降解，它們可能以較高的水平出現(xiàn)在受精囊中，并隨精子存在精液里。
在過去的幾年里，Evans博士參與蜜蜂基因組測序計(jì)劃，現(xiàn)在有一個蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)室從事蛋白質(zhì)的大規(guī)模研究，特別是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其功能，使人們能解剖特殊組織，例如精于或處女王的受精囊，分離其中的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)室然后能鑒定這些蛋白質(zhì)的性質(zhì)，并能從基因組項(xiàng)目找出與其匹配的蛋白質(zhì)基劇順序。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在許多細(xì)胞變化過程中是關(guān)鍵的物質(zhì)，可以使我們了解受精囊里發(fā)生的事情。這是一項(xiàng)令人激動的尖端科學(xué)，我們衷心希望能獲得一些解答，或者得到另外的種質(zhì)保存的手