摘 要：從中華蜜蜂(Apis.cerana cerana)線粒體DNA 中擴增出完整的細胞色素氧化酶II（Ac-COII）和III（Ac-CoIII）基因。兩者長度分別為681bp和780bp，Ac-CoII可編碼226個氨基酸殘基的多肽，與意大利蜜蜂在核苷酸水平和氨基酸水平的一致性分別為90％和95％。Ac-CoIII可編碼259個殘基的蛋白，與意大利蜜蜂在核苷酸水平和氨基酸水平的一致性分別為84％和79％。利用COII的序列信息進行分析能夠反映各不同蜜蜂種類之間的系統進化關系。

關鍵詞：細胞色素氧化酶II和III；中華蜜蜂；序列分析；分子進化

線粒體是細胞重要的細胞器，上面分步許多與呼吸代謝相關的酶類，是生物能量代謝的主要場所，在維系細胞正常功能方面具有重要的作用[1]。線粒體具有自主獨立的基因復制和遺傳方式，在生物體體內是母系遺傳的。因而在研究物種的系統進化關系方面具有重要的意義。圍繞不同生物種類的線粒體基因、基因組序列已經完成了許多工作[2-4]，對于我們理解線粒體的功能和相關物種的系統進化關系具有重要作用。

意大利蜜蜂的線粒體基因組測序工作已經完成[5]，上面總共編碼22個轉移RNA基因，13個與呼吸代謝密切相關的代謝酶類和2個核糖體基因。由于線粒體基因是母系遺傳的，在研究物種之間的系統進化關系具有重要意義，蜜蜂線粒體的許多蛋白編碼基因包括NADH, 16sRNA, 28sRNA, COII, COI, ATPase[6-8]等均曾被用于分析物種之間的系統進化關系。

中華蜜蜂是我國的一個有重要經濟價值的蜜蜂種類，在我國大面積飼養。其傳統的分類學地位只是在形態學的指標上予以說明。在基因水平上是什么情況還沒有工作涉及。本研究克隆了中華蜜蜂細胞色素氧化酶的II單位和III單位基因，并與GenBank內的蜜蜂同源序列進行比對和系統進行關系的分析，以期從分子的角度對我國中華蜜蜂的分類地位予以確定，為相關的研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

中華蜜蜂采自浙江大學昆蟲研究所蜂場，PGEM –T easy 載體、Taq DNA 聚合酶購自Promega公司, Trizol、EcoRI，DNA Marker,低熔點凝膠購自Takara 公司, TG1為宿主菌。

1.2 方法

1.2.1 蜜蜂線粒體基因組DNA的提取

蜜蜂線粒體基因組DNA的提取按照Crozier 等[9]的方法進行。大約9g的蜜蜂胸部組織勻漿于300 ml 0.1 M Tris-HCL緩沖液，pH 7.5，內含0.25 M蔗糖, 0.01 M NaCL, 和0.05 MEDTA。通過差速離心來收集線粒體，重懸于12 ml pH 8.0, 0.2 M Tris-HCL 緩沖液，內含0.1 M EDTA 和1% SDS。加蛋白酶K至終濃度為90 μg/ml，然后60℃孵育2hr，16000g離心10min，去上清，加2ml 5 M醋酸鉀 pH 6 ，冰上放置30min，12000g離心10min，上清經酚、氯仿多次抽提去蛋白，最后酒精沉淀線粒體DNA，溶于適量體積的TE緩沖液，－20℃保存備用。

1.2.2 引物設計和目標片段的PCR擴增

用于擴增中華蜜蜂COII和COIII的引物序列參照已經完成的意大利蜜蜂的線粒體基因組序列來進行(Genebank Acession：L06178)，在COII和COIII兩側分別設計特異性引物，其中用于擴增COII的引物序列為：F1：5’-ATG GCA GAA TAA GTG CAT -3’，R1：5’-CAA CTC TTA TAA TTC AGA CAT C-3’，用于擴增COIII的引物序列為：F2：5'-CAG CAA ATT TAA TTT CTG GAC-3'，R2:5'-GTA ATT GGA TTA AAT CCA CAT TC-3'。以蜜蜂的線粒體基因組DNA為模板PCR擴增出目的基因。PCR 擴增的條件為94 ℃變性3min，然后為94 ℃ 變性45 s, 54 ℃ 45 s,72 ℃60min, 共30個循環。RT -PCR 產物用2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。低熔點凝膠回收分離目的片段, 與載體的連接、轉化, 酶切鑒定重組克隆。由上海生工基因公司測定DNA序列。

1.2.3 序列分析和用于比對的序列來源

測序的結果用GenBank/EMBL內的Blast軟件進行蜜蜂同源序列的搜尋和分析，利用CLUSTAL1.8進行序列的多重比對。進化分析利用PAUP (version 4.0 Beta)軟件進行，方法為最大簡約法。用于分析的序列來源為（GenBank的接入號）：Apis mellifera(11990602); Apis dorsata(11761415); Apis koschevnikovi haplotype 1—2 (11761411, 11761413); Apis cerana haplotype 1—8 (11761395, 11761397, 11761399, 11761401, 11761403, 11761405, 11761407, 11761409); Apis nuluensis(11761393)，我們自己的CoII測序結果名為Achz; COIII 來自Apis mellifera (L06178)。

2 結果

2.1 C0II 和 CoIII 基因的PCR 擴增及基因克隆

以中華蜜蜂的線粒體DNA為模板，設計的特異性引物順利擴增了編碼Ac-COII和Ac-COIII的線粒體DNA片段，大小分別為960bp和1300bp（圖1），與預期的大小相符。擴增的片段與PGEM－T eazy 載體連接，經酶切鑒定與PCR擴增的大小一致（圖2）。

圖 1 從線粒體基因組DNA PCR擴增的COII和COIII

圖 2 擴增的COII和COIII與T載體連接后的酶切鑒定

2.2 序列分析

PCR成功擴增了華蜜蜂的完整的COII序列（Ac－CoII）和COIII序列（Ac－CoIII）。其中編碼Ac-COII的序列全長為681bp，編碼一個226個氨基酸殘基的細胞色素氧化酶II單位（圖3），在核苷酸水平上，中華蜜蜂Ac-CoII序列較意大利蜜蜂的多三個核苷酸，一致性為90％。Ac-CoIII序列的長度為780bp，可編碼一長度為259個氨基酸殘基的蛋白，核苷酸水平的一致性為84％（圖4）。

一般生物體的線粒體DNA AT含量比較高。在中華蜜蜂的COII里含量為80.7％，而在意大利蜜蜂線粒體內是78.4％。兩者均低于意大利蜜蜂線粒體的平均AT％（83％）。在COIII基因內也有相同的趨勢，在中華蜜蜂和意大利蜜蜂體內分別為80％和83％。意大利蜜蜂COIII的AT％與線粒體的平均值相同。

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 圖 3 細胞色素氧化酶II單位的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

在所擴增的Ac－COII片段上游同時包含了tRNAleu和隨后的一小段非編碼序列，該段非編碼序列在中華蜜蜂體內是88bp，在意大利蜜蜂體內是201bp。Ac－CoII的下游序列則包含了tRNAArg的基因序列和隨后的6bp非編碼序列，其在意大利蜜蜂體內為7bp。

擴增的Ac-CoIII 序列上游包含部分的ATpase6基因和隨后的18bp的非編碼序列，該序列在意大利蜜蜂體內是21bp。Ac－CoIII的下游序列則包括一個56bp的非編碼區（在意大利蜜蜂體內為70bp）、tRNAGly基因和部分的NADH3基因。

兩種蜜蜂的COII在氨基酸水平上有95％的一致性，總計有12個氨基酸殘基不同。其中大多數不同的氨基酸殘基具有相似的化學性質，只有2個氨基酸殘基發生化學性質不同的替代，這種情況對于維系CoII的活性是非常重要的。利用軟件對兩種蜜蜂的CoII進行疏水性的分析表明兩者具有基本一致的疏水性特征。Ac－CoII比意大利的CoII在C末端多出一個氨基酸殘基，對酶的活性影響不大。

CoIII在兩種蜜蜂之間具有79％的一致性，有33個氨基酸殘基發生了變化，其保守性較CoII小許多。可能意味著COIII在功能上較COII的作用要小一些。

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圖 4 細胞色素氧化酶III單位的核苷酸序列和氨基酸序列

在GenBank內越來越多的核苷酸和蛋白序列使得我們有可能利用CoII序列的信息進行系統進化的分析。我們采用PAUP軟件的最大簡約法來對已知的蜜蜂CoII序列進行進化分析，結果見圖5。我們所測定的中華蜜蜂的CoII序列與其他已經獲得的CoII序列很好的落在同一個分支內，其他蜜蜂種類在不同的分支內，能夠反應蜜蜂的系統進化關系。

3 討論

克隆的這兩個基因所包含的非編碼區序列均比意大利蜜蜂的對于序列要小，而位于tRNAleu和COII基因之間的最大的非編碼區在東方蜜蜂的體內變異很大，有些地理種群同意大利蜜蜂的相差無幾，而另一些則可能完全缺失[10]。因此，從進化的角度上來說，中華蜜蜂更原始一些。

圖 5 基于COII的核苷酸序列對不同種類及倍型的蜜蜂進行的系統進化樹的分析結果

從兩個亞基的氨基酸序列分析來看，CoII發生改變的氨基酸殘基少一些，一致性更高一些，在改變的氨基酸殘基里大多是趨于相同性質的氨基酸殘基的，對于整個蛋白的結構和功能的影響不大。而CoIII則無論是在一致性、發生改變的氨基酸殘基的比例和性質均有較大的變化，因而在蛋白的結構和功能上的變化較CoII要大一些。這種情況表明CoII在進化的過程中更保守，擔負的生物功能更重要。相對來說CoIII的重要性要小一些。

蜜蜂的線粒體基因是母系遺傳的，在研究分析不同種類之間的系統進化關系時具有重要的意義。迄今為止，已有多種線粒體基因被用于系統進化關系的分析，包括NADH, 16sRNA, 28sRNA, COII, COI, ATPase 等等。隨著這方面資料的不斷的積累，可以利用基因的序列信息對它們的系統關系進行研究。本研究我們利用COII的核苷酸序列信息，對不同蜜蜂種類的系統關系進行研究，結果表明能夠明確的將各種類區別開來，即便是在東方蜜蜂的各不同亞種之間，也比較好的進行了分類。該序列信息是完全可以用于衡量物種系統關系的，具有一定的理論意義。

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福建農林大學蜂學學院 李江紅

浙江大學應用昆蟲研究所 張傳溪