摘要：[研究目的]為掌握線粒體DNA(mtDNA)在東方蜜蜂研究中的取得的進(jìn)展。[方法]本文總結(jié)了蜜蜂血DNA結(jié)構(gòu)特征、mtDNA標(biāo)記己研究技術(shù)和東方蜜蜂非編碼區(qū)和編碼區(qū)標(biāo)記的應(yīng)用情況。[結(jié)果] RNAleu-COⅡ區(qū)和部分COⅡ區(qū)的酶切和測序均發(fā)現(xiàn)了豐富的多態(tài)性。RNAleu-COⅡ區(qū)和部分編碼區(qū)標(biāo)記能較好地解決泰國、菲律賓東方蜜蜂的種群遺傳分化問題。根據(jù)RNAleu -COⅡ區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將東方蜜蜂分成5個類型，并推測了他們的地理發(fā)育關(guān)系。[結(jié)論]mtDNA標(biāo)記是解決東方蜜蜂遺傳學(xué)和進(jìn)化學(xué)問題較好的標(biāo)記，增加樣本量和研究的區(qū)段能解決mtDNA存在的不足。

關(guān)鍵詞：東方蜜蜂；線粒體DNA；遺傳多樣性；遺傳分化

線粒體是真核細(xì)胞中進(jìn)行能量代謝的細(xì)胞器，線粒體DNA(mtDNA）位于線粒體中，屬核外遺傳物質(zhì)。mtDNA具有基因組小、多拷貝、基因排列簡單、無重組、遵循母性遺傳等特點，其快速進(jìn)化區(qū)和慢速進(jìn)化區(qū)鑲嵌，許多片段存在多態(tài)性。在個性進(jìn)化論和分子鐘理論指導(dǎo)下，mtDNA被廣泛用于分類、系統(tǒng)發(fā)育、生物地理學(xué)、種群遺傳學(xué)和法醫(yī)學(xué)研究。mtDNA 標(biāo)記在西方蜜蜂的亞種分類、亞種系統(tǒng)發(fā)育、起源進(jìn)化、生物地理學(xué)、種群遺傳結(jié)構(gòu)和非洲化蜜蜂等研究中得到廣泛的應(yīng)用。

通過文獻(xiàn)研究，本文對東方蜜蜂 mtDNA 特征及其在東方蜜蜂的遺傳多樣性、遺傳分化及東方蜜蜂生物地理學(xué)等研究應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行歸納分析，并探討本領(lǐng)域研究中存在的問題。

1 東方蜜蜂的mtDNA

目前西方蜜蜂 mtDNA 基因組已測序，但東方蜜蜂的 mtDNA 基因組尚未測序，根據(jù)mtDNA在近緣種間保守性，可以利用西方蜜蜂相應(yīng)區(qū)域來研究東方蜜蜂 mtDNA。

1.1 東方蜜蜂mtDNA基因組結(jié)構(gòu)

西方蜜蜂的線粒體基因組序列全長16343 bp，包括37個編碼基因和2個非編碼區(qū)，其物理結(jié)構(gòu)已清楚(圖1)。

東方蜜蜂的mtDNA基因組結(jié)構(gòu)與西方蜜蜂相似。研究發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂COⅡ、COⅢ的全序列與西方蜜蜂的相似性分別達(dá)80％以上。位于tRNAleu和COⅡ之間的非編碼區(qū)為蜜蜂屬特有，不同的種間存在長度差異，東方蜜蜂該非編碼區(qū)約89～97 bp，比西方蜜蜂的要短圓。

1.2 東方蜜蜂mtDNA分子標(biāo)記的特點

mtDNA 遵循母系遺傳，一只蜜蜂就能代表整群蜂 mtDNA 特征，因此為遺傳研究提供了一條高效的途徑。mIDNA進(jìn)化速率較快，適用于作種下階元的分子標(biāo)記，如 tRNAleu-COⅡ、ATPase6 - ATPase8、lrRNA、srRNA、COⅠ和COⅡ等用于解決東方蜜蜂種群遺傳分化、遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育問題。

1.3 東方蜜蜂mtDNA分子標(biāo)記的研究技術(shù)

mtDNA的研究技術(shù)主要是限制性酶切片段多態(tài)性(RFLP和序列分析。RFLP技術(shù)耗資少、節(jié)約時間，適于快速的大樣本量分析。能產(chǎn)生多態(tài)性片段的酶數(shù)量少，而且只能反映酶切位點的變異，RFLP技術(shù)反映標(biāo)記的遺傳變異時有一定局限性。序列測序提供了更豐富的遺傳信息，有取代RFLP的趨勢，但目前序列分析成本較高。

2 mtDNA在東方蜜蜂遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

遺傳多樣性研究是種質(zhì)資源保護(hù)和利用的理論依據(jù)。近年來東方蜜蜂種群分布范圍萎縮，種群數(shù)量銳減，其遺傳多樣性研究倍受關(guān)注。

該領(lǐng)域的研究共同存在樣本量小的問題，小樣本量不能充分反映遺傳多樣性水平，所以在新近研究中不斷有新單倍型發(fā)現(xiàn)，多樣性研究還不夠充分。

受分子生物學(xué)研究技術(shù)的限制，有限位點的研究，是否能夠代表樣本的遺傳多樣性水平還存有疑慮。位點的選擇是解決該問題的技術(shù)關(guān)鍵。

2.1 東方蜜蜂tRNAleu-COⅡ量區(qū)多樣性研究

tRNAleu-COⅡ區(qū)在東方蜜蜂種群遺傳多樣性研究中使用較多，不同分布區(qū)的東方蜜蜂中發(fā)現(xiàn)較多酶切類型和序列單倍型，反映了東方蜜蜂存在遺傳多樣性。

2.1.1 酶切類型多樣性

目前發(fā)現(xiàn)DraI、BgⅢ、EcoRV、HaeⅢ、HinfⅠ、NdeⅠ在東方蜜蜂tRNAleu-COⅡ具有一定酶切片段多態(tài)性，Dral酶反映該區(qū)的多態(tài)性最好，應(yīng)用較多。

利用DmⅠ酶切研究東方蜜蜂多樣性取得較好效果。在中國大部分地區(qū)中華蜜蜂檢測到4種類型，秦嶺地區(qū)發(fā)現(xiàn)4種，其他各地區(qū)僅1種；在泰國全國范圍發(fā)現(xiàn)了7種類型；在菲律賓47群東方蜜蜂檢測到4種類型，其中有1種酶切類型與中國的相同。

其他酶類在不同地區(qū)的樣本中反映的遺傳多樣性不夠豐富。東南亞7個地區(qū)的27群東方蜜蜂中，泰國樣本在BgⅢ、EcoRV、HaeⅢ、HinfⅠ、NdeⅠ等酶切位點上存在多態(tài)性，其中南部與北—中部蜜蜂在2個酶切位點上存在差異。越南樣本僅在HinH存在多態(tài)性，臺灣的蜜蜂僅在BdⅡ和HaeⅢ酶切位點上存在多態(tài)性。尼泊爾、日本本州島樣本經(jīng)10個酶切后未發(fā)現(xiàn)長度多態(tài)性。

2.1.2 非編碼區(qū)序列多樣性

東方蜜蜂檢測到的tRNAleu-COⅡ的非編碼區(qū)序列變異類型較為豐富，共發(fā)現(xiàn)70余種單倍型。東南亞諸島已發(fā)現(xiàn)40余種單倍型，新單倍型數(shù)據(jù)還在增加，比亞洲大陸單倍型種類豐富(表1)，這可能是島嶼間的生境異質(zhì)和隔離導(dǎo)致東方蜜蜂分化。中國范圍內(nèi)東方蜜蜂已發(fā)現(xiàn)近40種單倍型，遺傳多樣性較豐富。Japan1型所占比例較大，其他單倍型所占比例均較少。日本樣本中Japan1型比例高達(dá)98.9％，僅在對馬島和大島各發(fā)現(xiàn)1種新單倍型，該區(qū)域的遺傳多樣性缺乏。

2.2 東方蜜蜂mtDNA編碼區(qū)多樣性研究

東方蜜蜂mtDNA編碼區(qū)某些位點也具有一定的多態(tài)性，利用mtDNA編碼區(qū)的多態(tài)性能夠研究東方蜜蜂遺傳多樣性。泰國東方蜜蜂的ATPase6-ATPase8經(jīng)TaqⅠ，VspⅠ和VspⅠ酶切，發(fā)現(xiàn)8種線粒體型，而對IrRNA基因的DmⅠ酶切，僅發(fā)現(xiàn)4種酶切類型。此外，中國東方蜜蜂COⅡ編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn)了13種單倍型，其中秦嶺地區(qū)東方蜜蜂多樣性較豐富，后發(fā)現(xiàn)云南樣本也存在一些變異。由于文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)不充分，還不能對COⅡ遺傳多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

3 mtDNA在東方蜜蜂遺傳分化中的應(yīng)用及存在的問題

東方蜜蜂分布于無數(shù)不連續(xù)、異質(zhì)的生境，在長期進(jìn)化過程中，不同地理種群在遺傳結(jié)構(gòu)上逐漸趨異，形成適應(yīng)不同生境的地理種群，許多研究者利用mtDNA標(biāo)記也證實了不同地區(qū)的東方蜜蜂存在遺傳分化。

利用mtDNA標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)泰國不同地區(qū)東方蜜蜂的遺傳結(jié)構(gòu)存在較大分化。早先10個內(nèi)切酶對tRNAleu-COⅡ研究，初步發(fā)現(xiàn)泰國南、北部的東方蜜蜂存在差異。隨后對泰國北部、東北部、中部、泰國半島、Phuket和Samui 6個地區(qū)東方蜜蜂的COⅠ-COⅡ區(qū)，srRNA，IrRNA，ATPase6-ATPase8片段進(jìn)行酶切分析，發(fā)現(xiàn)克拉地峽以北、泰國半島—Phuket、Samui的種群間遺傳結(jié)構(gòu)存在明顯遺傳分化，這一研究結(jié)果也得到了形態(tài)標(biāo)記和微衛(wèi)星標(biāo)記研究結(jié)果的支持。

mtDNA標(biāo)記分析也揭示菲律賓各島間東方蜜蜂存在遺傳分化。來自菲律賓47只樣本采用tRNAleu-COⅡ的DmⅠ酶切，發(fā)現(xiàn)Luzon、Palawan和Visayan群島—Mindanao的東方該區(qū)酶切類型存在遺傳差異，這可能是更新世海平面上升后各島間的東方蜜蜂因長期隔離形成種群遺傳分化的結(jié)果間。

mtDNA標(biāo)記作為較成熟分子標(biāo)記，已經(jīng)在遺傳分化研究工作中發(fā)揮了較大的作用，但也存在一些問題。

3.1 研究范圍較大，相對樣本數(shù)較少

樣本量對于遺傳分化研究是非常重要的，可直接影響到實驗結(jié)果。早期對東南亞東方蜜蜂遺傳分化研究中所用到的樣本量僅27群。到目前為止，很多研究中樣本量依然很小，仍然沒有達(dá)到30只/樣點的基本要求，僅泰國東方蜜蜂研究所用的樣本量基本滿足要求，這個問題應(yīng)該引起學(xué)者的注意。

3.2 mtDNA標(biāo)記研究結(jié)果與其他分子標(biāo)記技術(shù)研究的結(jié)果不一致

利用mtDNA標(biāo)記分析泰國東北部同北部—中部的東方蜜蜂結(jié)果顯示分化較弱或無分化，而微衛(wèi)星標(biāo)記證實他們有很強(qiáng)的分化；在菲律賓，根據(jù)非編碼區(qū)研究認(rèn)為Luzon的高海拔和低海拔之間、Visayan群島和Mindanao之間無分化，而形態(tài)學(xué)研究認(rèn)為他們均存在分化，從Visayan群島發(fā)現(xiàn)新的單倍型的趨勢來看，也支持Visayan群島和Mindanao之間存在分化。根據(jù)非編碼區(qū)分析結(jié)果，PalawM可能存在兩個類群，而形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)僅支持一個類群。使用不同標(biāo)記，可能會導(dǎo)致結(jié)果存在分歧，應(yīng)綜合分析多種遺傳標(biāo)記的遺傳信息，得出更接近客觀的結(jié)果。

4 mtDNA在東方蜜蜂生物地理學(xué)中應(yīng)用

東方蜜蜂生物地理學(xué)主要研究該種的地理分布格局及該種在地理分布上形成的歷史，根據(jù)tRNAlue-COⅡ非編碼區(qū)的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可以對各島嶼間、島嶼—大陸間東方蜜蜂地理分布的歷史進(jìn)行推測。

東方蜜蜂的系統(tǒng)發(fā)育研究取得一定的進(jìn)展。到目前為止，根據(jù)tRNAleu-COⅡ非編碼區(qū)單倍型間進(jìn)化關(guān)系，將東方蜜蜂分成5個類型：(1)亞洲大陸型(包括韓國、日本、印度南部、尼泊爾、緬甸、越南、老撾、柬埔寨、泰國北部)；(2)Sundaland型(包括馬來半島、馬來西亞、印尼)；(3)Palawan型(僅Palawan島)；(4)菲律賓型(包括Luzon、Mindanao、Visayan群島)；(5)平原型(包括印度南部、斯里蘭卡)。

根據(jù)tRNAleu-COⅡ非編碼區(qū)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對亞洲各島嶼間、島嶼—大陸間東方蜜蜂分布格局的形成原因進(jìn)行了推測。馬來半島、馬來西亞、印尼各島(合稱Sunda板塊)曾與亞洲大陸接觸或僅以狹窄的水域相隔，兩地的東方蜜蜂存在遷移和基因交流；隨著海平面升高和板塊擠壓，Sunda板塊與大陸逐漸隔開，Sunda板塊分割成許多島嶼，阻礙東方蜜蜂的基因交流；Palawan 島曾在中更新世借婆羅洲與亞洲大陸相接，而 Luzon、Mindanao、Visayan 群島則從未與亞洲大陸接觸過。進(jìn)一步，Smith 認(rèn)為冰川時期亞洲北部不適于東方蜜蜂生存，只有越南、老撾、柬埔寨這些地方(單倍型豐富)適合東方蜜蜂避難，避難后的東方蜜蜂才擴(kuò)散到亞洲北部地區(qū)。

此外，來自中國北方、臺灣、蘇拉威西島和桑義赫群島的部分樣本發(fā)現(xiàn)了非編碼區(qū)嚴(yán)重缺失現(xiàn)象，對這些缺失的非編碼區(qū)的起源、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還無法解釋，可能是獨立進(jìn)化的特例。

利用mtDNA標(biāo)記研究不同分布區(qū)的東方蜜蜂系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和推測東方蜜蜂現(xiàn)今分布格局的發(fā)展歷史的結(jié)果，在宏觀尺度下是合理的。若要對東南亞的生物—地理發(fā)育歷史客觀合理認(rèn)識，還需結(jié)合其他物種生物地理學(xué)資料來證實。

參考文獻(xiàn)(略)

《中國蜂業(yè)》2009，59（5）

徐新建 周冰峰 朱翔杰 吳顯達(dá)

福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院